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Modifications méthylomiques en réponse à la supplémentation en micronutriments et au génotype de MTHFR[1]

 

Les stimuli environnementaux peuvent moduler l'activité du gène humain, entraînant des modifications épigénétiques de l'ADN. Des modifications du type de marques épigénétiques sur l'ADN, telles que la méthylation de la cytosine, ont été largement impliquées dans le développement de nombreuses maladies clés, notamment le cancer, les troubles neuropsychiatriques, les maladies cardiovasculaires et l'obésité. Il y a un intérêt considérable et une conjecture autour du développement potentiel de manipulations épigénétiques ciblées pour le traitement d'une maladie. Comprendre les conditions qui contribuent aux modifications de la méthylation de l’ADN et les implications de tels changements est fondamental pour l’étiologie et le traitement efficace d’une maladie.

Les modèles de méthylation de l'ADN sont initialement établis au cours de la gamétogenèse, de la fécondation et du développement in utero et permettent l'expression des gènes d’une manière spécifique aux tissus ou aux cellules, ce qui est important pour la croissance, la différenciation, l'immunité et le vieillissement des cellules. Cependant, un sous-ensemble de marques est dynamique tout au long de la vie et peut être modifié par des interactions avec des stimuli environnementaux tels que la fumée de cigarette, les polluants, le stress oxydatif et la consommation d'alcool. Bien qu'il soit admis que des facteurs environnementaux, y compris la nutrition, puissent favoriser les modifications épigénomiques, on en sait très peu sur le temps d'exposition et la posologie nécessaires pour que des changements se produisent. Les durées d'exposition et la posologie requises pour que les éléments composant l’alimentation modifient les profils de méthylation de l'ADN sont en grande partie inconnues.

On a émis l'hypothèse que, pendant la période de croissance lente (de 8 à 12 ans), l'expression des gènes est particulièrement sensible aux stimuli environnementaux tels que le régime alimentaire, ce qui est susceptible de refléter des modifications épigénétiques. Nous avons examiné si le traitement par micronutriments (comprenant principalement des vitamines, des minéraux et des acides aminés) était en corrélation avec les changements de méthylation de l'ADN génomique mesurés dans le sang périphérique, susceptibles de se produire par le biais d'une des voies du métabolisme du carbone. Cette étude a été réalisée sur un échantillon d'enfants âgés de 7 à 12 ans, atteints d'un trouble déficit de l'attention/hyperactivité (TDAH). Ces personnes faisaient partie d'un sous-groupe d'enfants ayant participé à un essai contrôlé randomisé (ECR) en double aveugle de 10 semaines comparant un traitement par micronutriments à large spectre à un placebo afin d'étudier les effets thérapeutiques sur les symptômes du TDAH. Dans cette étude, l'administration de micronutriments était associée à une amélioration fonctionnelle d’ensemble, déficience réduite et inattention améliorée, régulation émotionnelle et de l'agressivité par rapport au placebo.

Cette analyse systématique est unique dans la mesure où le traitement a été administré à l’aide d’un modèle ECR, ce qui permet la comparaison directe des niveaux de pré- et postméthylation. Notre analyse fournit également une avancée significative par rapport aux techniques traditionnelles, car elle évalue les niveaux de méthylation de l’ADN à environ 800 000 sites CpG dans le génome humain, avec une résolution nucléotidique. Cette approche permet d'évaluer les augmentations et les diminutions individuelles des niveaux de méthylation de l'ADN, à des loci de gènes spécifiques.

Le cycle du métabolisme du carbone fournit une voie intéressante par laquelle des facteurs environnementaux, tels que le régime alimentaire, pourraient directement influer sur les modèles de méthylation de l'ADN. La S-adénosylméthionine (SAM) est un co-substrat important qui est régénéré par le métabolisme du carbone et facilite la conversion de la cytosine en 5-méthylcytosine en fournissant aux enzymes de l'ADN méthyltransférase (DNMT) un groupe méthyle labile. Il a été démontré que des fluctuations cellulaires dans les niveaux de SAM affectaient l'activité de la méthyltransférase avec des conséquences épigénétiques potentielles. De nombreux micronutriments alimentaires, y compris le folate, la bétaïne, la choline, la riboflavine, la vitamine B6 et la vitamine B12, agissent en tant que co-facteurs et régulateurs d'un métabolisme du carbone, et plusieurs études ont démontré que les niveaux globaux de méthylation de l'ADN étaient corrélés aux concentrations sanguines en folate. De plus, les mutations géniques qui réduisent l'activité enzymatique, telles que le gène de la méthylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR), peuvent également altérer les profils de méthylation à l'échelle du génome, bien que les preuves expérimentales à ce sujet soient limitées et contradictoires. Le fait de perturber la biodisponibilité de la SAM pourrait entraîner une modification du profil de méthylation, ce qui fournirait un mécanisme permettant aux facteurs environnementaux de moduler la méthylation de l'ADN et d'influencer l'activité des gènes.

Le gène MTHFR code pour une enzyme limitant la vitesse du métabolisme du carbone et les variants génétiques de MTHFR entraînent une réduction de la fonction enzymatique, ce qui peut correspondre à une accumulation de folates dans le sang. L’interaction des deux génotypes de MTHFR (C677T et A1298C) semble être un facteur déterminant des profils de méthylation de l’ADN. L'hétérozygotie composée est probablement à l'origine des effets observés et les futures études devront incorporer des méthodes d'haplotypage appropriées pour ces variants. Nos études sur la supplémentation en micronutriments présentaient plusieurs points forts, notamment le plan d'échantillonnage par appariement qui a permis d'évaluer la variation au sein de chaque individu au cours de la période d'essai. Bien que le grand nombre de sites CpG du réseau de méthylation ait considérablement diminué la puissance statistique après correction pour les tests multiples, cela a permis une évaluation à l'échelle du génome. Ceci a été partiellement compensé par les niveaux de méthylation hautement conservés observés dans notre étude, ce qui est probablement dû au jeune âge des participants et à la petite fourchette d'âge observée dans l'étude (cinq ans, du plus jeune au plus âgé). Les profils de méthylation conservés de l'échantillon à l'étude ont permis de détecter de faibles changements de méthylation et, même avec une puissance statistique accrue, il semble peu probable que nous aurions observé des effets plus importants pour l'étude des micronutriments.

Cette recherche exploratoire représente sans doute la première analyse, à l'échelle du génome, des modifications de la méthylation de l'ADN au cours d'un essai visant à apporter une supplémentation alimentaire en vitamines, minéraux et acides aminés à large spectre chez l'homme.

Les modifications de la méthylation à l'échelle du génome d'échantillons de sang périphérique apppariés [allant ensemble] ont été évaluées. La méthylation a augmenté dans 84% des CpG méthylés de manière différentielle les plus significatifs ; cependant, aucune ne s’est révélé significative après ajustement pour le test à l'échelle du génome. Il est peu probable que la supplémentation en micronutriments ait un effet biologique important sur la méthylation de l'ADN sur 10 semaines ; cependant, la tendance à l'hyperméthylation que nous avons observée risque de devenir plus marquée avec des périodes d'exposition plus longues.

Les résultats suggèrent une tendance générale à une augmentation de la méthylation dans le groupe de traitement ; cependant, aucune association spécifique de gène n'a été identifiée. Ceci suggère que les effets potentiels de la supplémentation en micronutriments sur la méthylation de l'ADN sont susceptibles de correspondre à de petits changements à l'échelle du génome, plutôt que des effets spécifiques de gènes, et donc que la méthylation de cytosine n'est pas susceptible de jouer un rôle immédiat dans les impacts bénéfiques observés de la supplémentation alimentaire du TDAH. L’ampleur des changements observés peut augmenter proportionnellement au temps d’exposition. Il est probable que le génotype du régime alimentaire et du MTHFR interagissent tous deux pour déterminer les résultats épigénétiques.

 

Les durées d'exposition et la posologie requises pour que les éléments composant l’alimentation modifient les profils de méthylation de l'ADN sont en grande partie inconnues. Objectif : cette recherche exploratoire constitue la première analyse, à l'échelle du génome, des modifications de la méthylation de l'ADN au cours d'un essai contrôlé randomisé (ECR) visant à apporter une supplémentation alimentaire en vitamines, minéraux et acides aminés à large spectre chez l'homme. Méthodes : les modifications de la méthylation à l'échelle du génome d'échantillons de sang périphérique apppariés [allant ensemble] ont été évaluées à l'aide de la matrice Infinium Methylation EPIC 850 K. Résultats : la méthylation a augmenté de 84% des CpG méthylés de manière différentielle les plus significatifs ; cependant, aucune ne s’est révélé significative après ajustement pour le test à l'échelle du génome. Conclusion : il est peu probable que la supplémentation en micronutriments ait un effet biologique important sur la méthylation de l'ADN sur 10 semaines ; cependant, la tendance à l'hyperméthylation que nous avons observée risque de devenir plus marquée avec des périodes d'exposition plus longues.

 

La modification épigénétique de l'ADN fournit une base mécanistique à travers laquelle les stimuli environnementaux peuvent moduler l'activité du gène humain. Des modifications du type de marques épigénétiques sur l'ADN, telles que la méthylation de la cytosine, ont été largement impliquées dans le développement de nombreuses maladies clés, notamment le cancer, les troubles neuropsychiatriques, les maladies cardiovasculaires et l'obésité. Les modifications épigénétiques étant dynamiques, il y a un intérêt considérable et une conjecture autour du développement potentiel de manipulations épigénétiques ciblées pour le traitement d'une maladie. Comprendre les conditions qui contribuent aux modifications de la méthylation de l’ADN et les implications de tels changements est fondamental pour l’étiologie et le traitement efficace d’une maladie, et constitue l’un des principaux défis actuels de la génétique humaine.

 

Les modèles de méthylation de l'ADN sont initialement établis au cours de la gamétogenèse, de la fécondation et du développement in utero et permettent l'expression des gènes d’une manière spécifique aux tissus ou aux cellules, ce qui est important pour la croissance, la différenciation, l'immunité et le vieillissement des cellules. Cependant, un sous-ensemble de marques est dynamique tout au long de la vie et peut être modifié par des interactions avec des stimuli environnementaux tels que la fumée de cigarette, les polluants, le stress oxydatif et la consommation d'alcool. La plupart des déductions d'effets de l’alimentation sur le méthylome humain sont tirées d'études sur des animaux ou d'événements dus à des conditions naturelles passés, tels que l’Hiver de la Faim Néerlandais et des événements similaires. Bien qu'il soit admis que des facteurs environnementaux, y compris la nutrition, puissent favoriser les modifications épigénomiques, on en sait très peu sur le temps d'exposition et la posologie nécessaires pour que des changements se produisent. De plus, peu d'études sur le changement de la méthylation ont été effectuées en utilisant une résolution spécifique d'un gène, qui peut donner un aperçu des implications biologiques potentielles.

 

On a émis l'hypothèse que, pendant la période de croissance lente (de 8 à 12 ans), l'expression des gènes est particulièrement sensible aux stimuli environnementaux tels que le régime alimentaire, ce qui est susceptible de refléter des modifications épigénétiques. Nous avons examiné si le traitement par micronutriments (comprenant principalement des vitamines, des minéraux et des acides aminés) était en corrélation avec les changements de méthylation de l'ADN génomique mesurés dans le sang périphérique, susceptibles de se produire par le biais d'une des voies du métabolisme du carbone. Cette étude a été réalisée sur un échantillon d'enfants âgés de 7 à 12 ans, atteints d'un trouble déficit de l'attention/hyperactivité (TDAH). Ces personnes faisaient partie d'un sous-groupe d'enfants ayant participé à un essai contrôlé randomisé (ECR) en double aveugle de 10 semaines comparant un traitement par micronutriments à large spectre à un placebo afin d'étudier les effets thérapeutiques sur les symptômes du TDAH. Dans cette étude, l'administration de micronutriments était associée à une amélioration fonctionnelle d’ensemble, déficience réduite et inattention améliorée, régulation émotionnelle et de l'agressivité par rapport au placebo.

 

Cette analyse systématique est unique dans la mesure où le traitement a été administré à l’aide d’un modèle ECR, ce qui permet la comparaison directe des niveaux de pré- et postméthylation. Notre analyse fournit également une avancée significative par rapport aux techniques traditionnelles, car elle évalue les niveaux de méthylation de l’ADN à environ 800 000 sites CpG dans le génome humain, avec une résolution nucléotidique. Cette approche permet d'évaluer les augmentations et les diminutions individuelles des niveaux de méthylation de l'ADN, à des loci de gènes spécifiques.

 

Discussion

Le cycle du métabolisme du carbone fournit une voie intéressante par laquelle des facteurs environnementaux, tels que le régime alimentaire, pourraient directement influer sur les modèles de méthylation de l'ADN. La S-adénosylméthionine (SAM) est un co-substrat important qui est régénéré par le métabolisme du carbone et facilite la conversion de la cytosine en 5-méthylcytosine en fournissant aux enzymes de l'ADN méthyltransférase (DNMT) un groupe méthyle labile. Il a été démontré que des fluctuations cellulaires dans les niveaux de SAM affectaient l'activité de la méthyltransférase avec des conséquences épigénétiques potentielles. De nombreux micronutriments alimentaires, y compris le folate, la bétaïne, la choline, la riboflavine, la vitamine B6 et la vitamine B12, agissent en tant que co-facteurs et régulateurs d'un métabolisme du carbone, et plusieurs études ont démontré que les niveaux globaux de méthylation de l'ADN étaient corrélés aux concentrations sanguines en folate. De plus, les mutations géniques qui réduisent l'activité enzymatique, telles que le gène de la méthylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR), peuvent également altérer les profils de méthylation à l'échelle du génome, bien que les preuves expérimentales à ce sujet soient limitées et contradictoires. Le fait de perturber la biodisponibilité de la SAM pourrait entraîner une modification du profil de méthylation, ce qui fournirait un mécanisme permettant aux facteurs environnementaux de moduler la méthylation de l'ADN et d'influencer l'activité des gènes.

Notre analyse a mesuré les changements de méthylation génomique à partir de cellules du sang périphérique au cours d'un essai clinique randomisé en double aveugle d'une durée de 10 semaines comparant un traitement par micronutriments et un placebo. Nous pensons que cette recherche exploratoire représente la première analyse à l'échelle du génome des changements de méthylation de l'ADN associés à une manipulation contrôlée des nutriments chez l'homme. Pour chaque individu, le changement de méthylation a été évalué à l'aide de la matrice Illumina Methylation EPIC850 K en soustrayant les valeurs de prétraitement des valeurs de post-traitement. La corrélation entre les modifications de la méthylation et du traitement a ensuite été évaluée à l'aide d'un modèle linéaire prenant également en compte les effets du tabagisme pendant la grossesse, le sexe et l'âge. Nous avons ensuite étendu cette analyse afin d'étudier l'effet de deux variants communs observés dans le gène MTHFR sur les profils de méthylation de l'ADN avant traitement.

Modifications méthylomiques au cours de l’essai de 10 semaines sur les micronutriments

Parmi les 100 sondes les plus utilisées, 84% ont démontré une augmentation de la méthylation, ce qui est nettement plus élevé que prévu si les effets étaient aléatoires. Cette observation suggère une tendance générale à une augmentation de la méthylation globale dans le groupe de traitement par rapport au groupe placebo. Cependant, cette observation n'était pas cohérente pour les niveaux de méthylation à l'échelle du génome (p > 0,05). Compte tenu de la tendance à l'augmentation de la méthylation globale, une classification hiérarchique des 100 sondes les plus significatives a été réalisée, ce qui a permis de différencier les groupes de traitement et de contrôle en fonction du changement de méthylation de l'ADN. Cependant, les sites CpG individuels présentaient une variation de l'ampleur de la méthylation inférieure à 5% et n'étaient pas significatifs après la correction pour les tests multiples à l'échelle du génome. Seules 11 sondes ont présenté une différence moyenne de méthylation supérieure à 10% entre le groupe de traitement et le groupe de contrôle. Ces sondes n'étaient pas associées de manière significative au traitement ; cependant, cela démontre que les fluctuations aléatoires de la méthylation génomique étaient très mineures pour cet échantillon, sur la période de 10 semaines.

Les deux sites CpG les plus significatifs se trouvaient dans le promoteur du gène NFASC et dans la région non codante du chromosome 3, en aval du gène ABCF3. La NFASC est une molécule d'adhésion cellulaire qui est largement exprimée dans le cerveau, où elle participe à la croissance des neurites et joue probablement un rôle dans le potentiel axonal par le biais d'une interaction avec les canaux sodiques voltage-dépendants. CDH13 et PLK4 ont été rapportés comme répondant aux taux de folate. L'expression de CDH13 a été associée à la concentration en folate dans les cellules cancéreuses et a également été identifiée comme gène de risque candidat pour le TDAH dans plusieurs études sur les GWAS. Les cadhérines sont des protéines dépendantes du calcium, qui jouent un rôle dans l'adhésion des cellules. La CDH13 est exprimée dans le cerveau où elle régule la croissance des cellules neuronales. Elle a également été proposée comme gène candidat puissant pour participer aux mécanismes cérébraux pertinents pour le développement et la cessation de la dépendance.

Il est possible que de petits changements au niveau de plusieurs gènes convergeant sur des voies biologiques identiques ou similaires puissent avoir un effet biologique combiné. Parmi les 100 sondes les plus significatives, nous avons observé une association significative avec les familles de gènes impliquées dans les voies de transduction olfactive. Le sens olfactif est biologiquement complexe et joue un rôle dans la perception de la nourriture et de la saveur. Le rôle de la méthylation et de la supplémentation en micronutriments n’est pas connu ; cependant, la voie dépend fortement des ions, tels que Ca2+.

Analyse des différences méthylomiques vis-à-vis du génotype MTHFR

Le gène MTHFR code pour une enzyme limitant la vitesse du métabolisme du carbone et les variants génétiques de MTHFR entraînent une réduction de la fonction enzymatique, ce qui peut correspondre à une accumulation de folates dans le sang. Dans notre échantillon, nous avons observé que le variant 677T était faiblement associé à une teneur en folate élevée (p = 0,07), ce qui suggère que ce variant pourrait expliquer en partie l'accumulation observée de folate. Cependant, MTHFR est l'une des nombreuses enzymes impliquées dans le métabolisme du folate, et il est probable que la variation d'autres gènes, tels que MTR ou MTRR, puisse également contribuer à des taux élevés de folate dans cet échantillon. Il y a eu de nombreuses spéculations concernant la contribution de mutations du gène MTHFR dans des maladies neuropsychiatriques, telles que l'autisme, la schizophrénie et le TDAH. Cette hypothèse n'est pas fortement corroborée par la littérature scientifique et, dans notre échantillon d'enfants atteints de TDAH, nous n'avons pas observé de fréquences de génotypes inhabituelles.

Une fonctionnalité réduite du gène MTHFR a également été proposée pour influer sur la méthylation globale de l’ADN. Nous avons donc recherché si le génotype de MTHFR était corrélé à une méthylation anormale de l'ADN dans notre groupe d'échantillons. Une région en amont du gène PM20D1 présentait une méthylation différentielle entre les homozygotes et les hétérozygotes communs. Parmi les 100 meilleures sondes méthylées différentiellement, les gènes ZNF827 et FAM160A2 ont montré une méthylation différentielle significative (adjp = 0,017). ZNF827 a été associé à l'autisme et FAM160A2 à la schizophrénie; cependant, il n'y a aucune preuve claire d'une interaction entre ces gènes et MTHFR. Il a déjà été démontré que les variants de MTHFR influaient sur la méthylation du gène SLC6A4, et nos 100 meilleures sondes comprenaient quatre gènes de la superfamille de porteurs de soluté, SLC9C2, SLC41A1, SLC43A3 et SLC2A8.

L'analyse de la voie de KEGG a démontré qu'il existait un enrichissement significatif en gènes correspondant aux voies métaboliques, à la résistance au platine et à la voie de signalisation de l'AMPK. Outre le rôle central que joue MTHFR dans le métabolisme du carbone et du folate, il a également été impliqué dans les résultats de survie après la chimiothérapie néoadjuvante à base de platine/5-Fu et la signalisation par l'AMPK. Deux sondes spécifiques au MTHFR ont été identifiées dans les 100 meilleures sondes, et le site de liaison de ces sondes est situé à environ 2 kb de notre région génotypée, ce qui indique qu'il ne s'agit pas d'un artefact spécifique du SNP. La pertinence biologique des voies identifiées fournit un support pour la corrélation entre le génotype MTHFR et la méthylation différentielle au niveau de ces régions de gènes.

Points forts et limites

Les résultats suggèrent que l’interaction des deux génotypes de MTHFR est un facteur déterminant des profils de méthylation de l’ADN. Cela indique probablement que l'hétérozygotie composée est à l'origine des effets observés et que les futures études devront incorporer des méthodes d'haplotypage appropriées pour ces variants. Nos études sur la supplémentation en micronutriments présentaient plusieurs points forts, notamment le plan d'échantillonnage par appariement qui a permis d'évaluer la variation au sein de chaque individu au cours de la période d'essai. Bien que le grand nombre de sites CpG du réseau de méthylation ait considérablement diminué la puissance statistique après correction pour les tests multiples, cela a permis une évaluation à l'échelle du génome. Ceci a été partiellement compensé par les niveaux de méthylation hautement conservés observés dans notre étude, ce qui est probablement dû au jeune âge des participants et à la petite fourchette d'âge observée dans l'étude (cinq ans, du plus jeune au plus âgé). Les profils de méthylation conservés de l'échantillon à l'étude ont permis de détecter de faibles changements de méthylation et, même avec une puissance statistique accrue, il semble peu probable que nous aurions observé des effets plus importants pour l'étude des micronutriments.

Cette analyse exploratoire présente plusieurs limites qui peuvent avoir masqué des résultats potentiels. Les changements de méthylation observés sont le reflet de l'ADN génomique isolé du sang périphérique et les résultats de notre étude peuvent ne pas représenter les tissus les plus affectés par la supplémentation alimentaire. Les recherches sur les effets méthylomiques de l'alimentation ont été limitées, et la corrélation entre les profils de méthylation du sang et les tissus métaboliquement pertinents n'a pas encore été examinée. Cependant, il existe de plus en plus de preuves de corrélations significatives entre les changements de méthylation de l'ADN dans les cellules du sang périphérique et les tissus centraux, tels que le cerveau. La courte durée de traitement de 10 semaines était une limitation importante, en particulier du fait que la majorité des changements épigénétiques importants sont associés à une exposition à long terme à des facteurs de stress environnementaux, tels que le tabagisme. Cependant, nos résultats ont une ampleur d'effet comparable à celle d'études similaires menées chez l'homme. De plus, les individus de notre étude n’avaient pas de régime alimentaire restreint et par conséquent, l’ampleur des changements méthylomiques devrait être inférieure à celle observée dans les cas extrêmes tels que ceux décrits par Waterland et al..

Conclusion

Les résultats suggèrent une tendance générale à une augmentation de la méthylation dans le groupe de traitement ; cependant, aucune association spécifique de gène n'a été identifiée après ajustement pour plusieurs tests. Ceci suggère que les effets potentiels de la supplémentation en micronutriments sur la méthylation de l'ADN sont susceptibles de correspondre à de petits changements à l'échelle du génome, plutôt que des effets spécifiques de gènes, et donc que la méthylation de cytosine n'est pas susceptible de jouer un rôle immédiat dans les impacts bénéfiques observés de la supplémentation alimentaire du TDAH. L’ampleur des changements observés peut augmenter proportionnellement au temps d’exposition, ce qui devrait être pris en compte dans les études futures. Les études futures dans ce domaine devraient également envisager d'augmenter la taille de l'échantillon et d'intégrer les effets du génotype sur l'analyse épigénétique, car il est probable que les génotypes du régime alimentaire et du MTHFR interagissent tous deux pour déterminer les résultats épigénétiques.

 

[1] Aaron J Stevens et al.