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L’enzyme TTLL3 est une glycine ligase (G-ligase) pour la tubuline, qui régule l'assemblage des cils. La glycylation pourrait agir en compétition avec la glutamylation.[1]

 

Résumé

 Nous montrons que les protéines TTLL3 agissent comme des tubulines glycine ligases avec une activité d’initiation de chaîne. Nous montrons également que, in vivo, l’acide glutamique et les glycine ligases s'opposent, probablement en compétition pour des sites de modification partagés sur la tubuline. Nous proposons que la glycylation de la tubuline agit directement ou indirectement en inhibant la glutamylation de la tubuline.

Introduction

Deux types de modifications post-traductionnelles (PTM) de tubuline, appelés polymodificationsla glutamylation et la glycylation – sont des ramifications peptidiques constituées de résidus glutamyle ou glycyle qui sont attachés au groupe γ-carboxyle des acides glutamiques des domaines de queue C-terminaux (CTT) de l'α- et de la β-tubuline. Récemment, nous avons identifié les enzymes tubuline acide glutamique ligase comme des protéines liées à la tubuline tyrosine ligase, connues sous le nom de protéines de type TTL (TTLL). Des études sur plusieurs ligases d’acide glutamique (E-ligases) indiquent que la glutamylation de la tubuline est importante pour l’assemblage des axonèmes. La perte de la sous-unité non catalytique de la TTLL1 E-ligase a conduit à des axonèmes de spermatozoïdes défectueux et à la stérilité des mâles chez la souris et la déplétion du TTLL6 a inhibé l’assemblage des cils olfactifs chez le poisson zèbre.

Le rôle de la glycylation de la tubuline reste inconnu, principalement parce que les enzymes modificatrices restent à découvrir. Ici, nous utilisons Tetrahymena pour identifier TTLL3 comme une tubuline glycine ligase (G-ligase) avec une activité d'initiation de chaîne. Ensuite, nous utilisons le poisson zèbre pour étudier l'importance de TTLL3 pendant le développement des vertébrés. Les études de déplétion basées sur le morpholino (MO) indiquent que TTLL3 est nécessaire pour l’allongement ou la stabilité des axonèmes. Dans les deux organismes, une réduction de la glycylation de la tubuline a conduit à une hyperglutamylation. Ainsi, la glycylation pourrait agir en compétition avec la glutamylation pour les sites de modification partagés sur la tubuline.

Résultats

La superfamille TTLL comprend des protéines qui interviennent dans la ligature des acides aminés aux protéines, y compris des enzymes qui catalysent la tyrosination de la tubuline et la glutamylation. Les TTLL10 murins glycylatent NAP1, mais on ne sait pas si un TTLL glycylate la tubuline. Des séquences TTLL3 sont présentes dans les organismes qui ont une glycylation de la tubuline, mais sont absents chez Trypanosoma et Plasmodium qui n'ont pas ce PTM. Ainsi, TTLL3 pourrait être une G-ligase pour la tubuline.

La déplétion de l'expression ttll3 produit des défauts dans l'asymétrie gauche-droite (LR) chez le poisson zèbre.

Chez les embryons de vertébrés, les cils mobiles sont nécessaires pour établir l’axe gauche-droite (LR) à la fin de la gastrulation. Chez le poisson zèbre, les premiers cils se forment dans un tissu appelé vésicule de Kupffer (KV), qui est analogue au nodus de la souris. Les perturbations des cils KV entraînent une inversion complète de l'axe LR, connu sous le nom de situs inversus, ou dans un axe LR randomisé, appelé hétérotaxie. Au cours du développement normal, le cœur en développement est situé sur le côté gauche de l'embryon, comme le révèle l’expression de la chaîne légère de myosine cardiaque 2 (cmlc2). Chez les morphants ttll3, en revanche, les cœurs étaient souvent situés sur le côté droit de l’embryon, ou le long de la ligne médiane. Conformément à cela, cmlc2 et lefty2 étaient souvent anormalement exprimés sur le côté droit, le long de la ligne médiane ou bilatéralement. Chez le poisson zèbre, l’asymétrie dans le cerveau est révélée par lefty1, qui s’exprime sur le côté gauche de l’épiphyse, une structure dans le diencéphale qui donne naissance à la glande pinéale. Chez les morphants ttll3, en revanche, l’ARNm de lefty1 était souvent présent sur le côté gauche, bilatéral ou sur le côté droit de l'épiphyse, indiquant que l’asymétrie dans le cerveau était également perturbée. Le gène lié nodalement, gaucher (spaw), est le premier marqueur de l’asymétrie LR et est normalement exprimé dans le mésoderme de la plaque latérale gauche. Chez les morphants ttll3, le spaw était souvent exprimé bilatéralement ou dans le mésoderme de la plaque latérale droite. L'injection de MO à séquence aléatoire de contrôle n’a pas conduit à des défauts conditionnels. L’injection de MO conçus pour épuiser les TTLL non TTLL3 (TTLL10 et -12) a produit une combinaison distincte de défauts, et aucun de ces MO n’a affecté l’asymétrie LR. Ces résultats suggèrent que la glycylation de la tubuline est nécessaire soit pour l’assemblage, soit pour la fonction des cils KV. En effet, nous avons constaté que les morphants avaient des cils KV moins nombreux et plus courts que les embryons témoins.

Discussion

Nous montrons que les protéines TTLL3 sont nécessaires pour la glycylation de la tubuline chez un protiste et chez un vertébré. La surproduction de TTLL3 chez Tetrahymena a conduit à une forte augmentation de la monoglycylation de la tubuline, mais pas de la polyglycylation, compatible avec l'activité d'initiation de chaîne. Une mutation qui inactive le domaine ATPase de TTLL3 a inhibé son activité G-ligase. Une étude distincte montre que les protéines TTLL3 des mammifères et de la drosophile assurent la médiation de l'activité G-ligase/initiase. L'explication la plus simple de toutes ces données est que TTLL3 est une tubuline G-ligase conservée avec une activité d'initiation de chaîne.

La perte de protéines TTLL3 a conduit à une réduction spectaculaire des niveaux de glycylation de la tubuline dans les cils de Tetrahymena et du poisson zèbre. Cependant, les mutants Tetrahymena dépourvus de tous les gènes TTLL3 ont un signal de glycylation de la tubuline résiduel dans les cils. Le TTLL10 mammifère médie l'activité d'élongation de la chaîne latérale de la glycine sur la tubuline. Cependant, TTLL10 peut directement glycyler un NAP1 recombinant, indiquant une capacité d'initiation. Ainsi, chez Tetrahymena, les enzymes TTLL10 pourraient initier des chaînes latérales sur la tubuline, peut-être seulement en l’absence de TTLL3. En variante, des types TTLL encore non caractérisés (par exemple, TTLL14 ou TTLL15) pourraient agir comme des G-ligases.

Les cellules Tetrahymena dépourvues de TTLL3 assemblaient des cils plus courts. Chez le poisson zèbre, le manque d’activité TTLL3 conduit à un raccourcissement dramatique ou à une perte complète des cils. Ainsi, les phénotypes de poisson zèbre et de Tetrahymena sont cohérents, bien que les cils soient moins touchés chez Tetrahymena, probablement en raison de l'action des G-ligases non TTLL3. Dans Tetrahymena, outre la tubuline, la seule protéine glycylée immunologiquement détectable est la Pgp1p, qui est ciblée sur le réticulum endoplasmique. Ainsi, les effets des déficiences en TTLL3 sur l'assemblage et la fonction des cils sont probablement médiés par la glycylation de la tubuline. Chez la drosophile, plusieurs protéines nonubulines subissent une glycylation dépendante de TTLL3. La drosophile peut être inhabituelle, car cette espèce n’a pas de TTLL10, et donc toute glycylation des protéines peut être dépendante de TTLL3. Nous ne pouvons cependant pas exclure la possibilité qu'une protéine distincte de la tubuline subisse une glycylation médiée par TTLL3 et contribue à la ciliogenèse chez Tetrahymena et le poisson zèbre.

La surproduction d'une forme déficiente en ATPase de Ttll3Ap chez Tetrahymena a conduit à un raccourcissement de l'axonème et des défauts structurels, y compris un manque d'assemblage des microtubules centraux. Ces effets peuvent s’expliquer soit par une inhibition compétitive des G-ligases TTLL3 et non TTLL3 qui agissent sur la tubuline, soit par une perturbation d’une autre fonction du CTT, telle que la glutamylation. Conformément à cette dernière hypothèse, une forte surexpression d'une E-ligase ciliaire, Ttll6Ap a donné un phénotype qui ressemble fortement à celui des cellules surexprimant DN-Ttll3Ap. Fait intéressant, l'expression de GFP-DN-Ttll3Ap a inhibé l’assemblage des microtubules centraux, tandis que l’enzyme elle-même et la glycylation de la tubuline semblent restreintes aux microtubules externes. Cette observation indique que l'assemblage des microtubules centraux dépend des propriétés des doublets externes.

Nous montrons ici que TTLL3, très probablement en modifiant la tubuline, est d’une importance critique pour l’assemblage des cils. Il reste à déterminer comment la glycylation de la tubuline affecte les microtubules ciliaires au niveau moléculaire. Ce PTM est présent principalement sur les microtubules axonémiques externes, et donc son absence pourrait inhiber l’IFT. Une réduction du taux de motilité IFT pourrait expliquer le raccourcissement des cils causé par des carences en TTLL3 à la fois chez Tetrahymena et chez le poisson zèbre. En effet, une mutation d’un sous-ensemble de sites de polymodification sur le CTT de la β-tubuline chez Tetrahymena a conduit à une accumulation de matériaux denses aux électrons près des microtubules externes dans les cils. Cependant, l'axonème du sperme chez la drosophile est fortement glycylé, mais s’assemble sans IFT. Ainsi, la conservation évolutive de la glycylation de la tubuline repose probablement sur une fonction distincte de l’IFT.

Les cellules TTLL3-nulles (et en particulier les axonèmes) ont montré une résistance accrue au paclitaxel, un agent stabilisant les microtubules. Alors que le paclitaxel se lie à l’intérieur du lumen du microtubule, il existe des interactions entre le lumen du microtubule et sa surface. Ainsi, la glycylation des CTT pourrait affecter indirectement le site de liaison du paclitaxel dans le lumen. Cependant, les axonèmes déficients en TTLL3 sont excessivement courts, ce qui suggère que la glycylation affecte le taux de renouvellement ou la stabilité des microtubules axonémiques. Dans les cellules de mammifères, la résistance au paclitaxel est associée à une dynamique accrue des microtubules cytoplasmiques. Les microtubules axonémiques échangent des sous-unités même lorsqu’ils sont entièrement assemblés. De manière inattendue, les axonèmes déficients en glycylation montrent une augmentation modérée de l’acétylation du K40, un marqueur des microtubules à vie longue, faisant valoir que l’absence de glycylation augmente, plutôt que diminue, le temps de séjour des sous-unités de tubuline. Pour réconcilier ces données, on peut considérer que l’absence de glycylation de la tubuline rend les microtubules axonémiques moins dynamiques et, en même temps, limite l’accès du paclitaxel à ses sites de liaison luminaux. Le paclitaxel diffuse à travers les parois des microtubules via de petites fenestrations. Le manque de glycylation de la tubuline sur les CTT pourrait réduire la taille de ces fenestrations. Comme les microtubules axonémiques sont recouverts de complexes protéiques et que leurs extrémités positives sont coiffées, la diffusion à travers la paroi du microtubule pourrait limiter la vitesse d’accumulation de concentration de paclitaxel à l’intérieur du lumen. Un réseau de microtubules plus serré pourrait également réduire le niveau de dynamique axonémique et favoriser l’accumulation d’acétylation de K40. Un manque de renouvellement approprié des microtubules axonémiques pourrait, à son tour, conduire à une taille plus courte des cils. Bien que contre-intuitif, il existe déjà des preuves que la katanine, un facteur qui favorise le renouvellement des microtubules par sectionnement, est nécessaire pour l’assemblage des axonèmes et interagit avec la tubuline modifiée post-traductionnellement.

Une autre preuve que le statut des polymodifications affecte l’organisation du réseau axonémique est fournie par les résultats de la surexpression de GFP-DN-Ttll3Ap. Dans ces cellules, les segments distaux de cils préexistants qui s’allongeaient à l’aide de tubuline hypoglycylée étaient apparemment instables. Puisque les cils préexistants étaient initialement mobiles, leur mouvement pourrait conduire à la rupture des segments distaux hypoglycylés/hyperglutamylés nouvellement assemblés. Ainsi, les axonèmes avec une composition anormale de polymodifications pourraient être plus fragiles, probablement en raison d’une flexibilité réduite. Les propriétés mécaniques du réseau pourraient être importantes à la fois pour les cils à motilité intrinsèque et les cils primaires qui se plient passivement en réponse à l’écoulement de fluide dans l’espace extracellulaire chez les mammifères. À l’appui de cette idée, la glycylation de la tubuline a été détectée chez les cils motiles et les cils primaires. Certains protistes, comme Trypanosoma, sont dotés de cils mobiles et de 9+2 axonèmes et manquent de glycylation de la tubuline, mais ces organismes assemblent une tige paraflagellaire, ce qui pourrait affecter les propriétés mécaniques du flagelle.

Nous montrons que les ligases G et E s’opposent sur la tubuline. Une réduction de la glycylation de la tubuline a augmenté les niveaux de glutamylation de la tubuline et, inversement, une réduction de la glutamylation de la tubuline a augmenté les niveaux de la glycylation de la tubuline. De plus, la surexpression de TTLL3 a réduit les niveaux de glutamylation de la tubuline et la surexpression de la TTLL6 E-ligase a réduit les niveaux de glycylation de la tubuline. Les deux polymodifications se produisent sur les acides glutamiques des CTT et peuvent coexister sur les mêmes CTT tubulines. Chez les ciliés, la glycylation se produit sur plusieurs acides glutamiques adjacents sur le CTT de la β-tubuline, mais les sites de glutamylation n’ont pas été cartographiés. Dans d’autres organismes, les sites de glutamylation sont situés au niveau des acides glutamiques adjacents ou chevauchant les sites de glycylation sur le CTT. Il est donc probable que les ligases G et E entrent en compétition pour les mêmes sites ou s’influencent mutuellement en bloquant stériquement les sites adjacents. Contrairement à la glutamylation de la tubuline, qui peut être présente dans tous les organismes avec axonèmes, quelques lignées (par exemple, Trypanosoma et Plasmodium) manquent de glycylation malgré la présence d'axonèmes. Il est tentant de supposer que la glutamylation de la tubuline est directement impliquée dans les propriétés de l’axonème, tandis que la glycylation de la tubuline agit comme un inhibiteur compétitif de la glutamylation de la tubuline. Les quelques lignées dépourvues de glycylation de la tubuline pourraient utiliser d’autres moyens pour diminuer les niveaux de glutamylation de la tubuline, y compris des enzymes non identifiées qui coupent les chaînes latérales du glutamyle.

 

[1] Dorota WLOGA et al., TTLL3 Is a Tubulin Glycine Ligasethat Regulates the Assembly of Cilia, Developmental Cell, Cell Press, DOI 10.1016/j.devcel.2009.04.00.

https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(09)00170-1?large_figure=true

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